m6A等RNA修饰的主要研究手段是通过MeRIP方法对发生修饰的片段进行富集，其后进行高通量测序分析修饰位点。无论是一篇展示修饰位点分布特点的谱学文章，还是深入研究修饰调控基因表达机制的文章，在高通量测序之后，通常都需要对筛选出来的部分修饰位点进行低通量的MeRIP-qPCR验证。这个实验简单却必不可少，但对于刚刚接触RNA修饰研究的小伙伴来说，可能对MeRIP-qPCR的方法原理、结果含义及展示方法等还存在一些疑问。在已发表文章中又常常是几句话带过，无法解答困惑，回头面对自己手里的数字，还是一头雾水。这次我们就在这里详细谈一谈MeRIP-qPCR的一些相关问题.

  MeRIP-qPCR是验证某目标基因上的某个修饰位点（以一小段区域的形式，MeRIP法精确不到单碱基）的修饰水平。得到的结果往往是一个%（IP/Input）的数值，它体现的是该位点的修饰水平（能够理解为：这个转录本表达了很多条，其中这个位点有修饰的有多少条？）。与普通qPCR验证基因表达水平的不同，普通PCR一般是验证基因的表达量（能够理解为：基因转录本表达了多少条？）。

  顾名思义，MeRIP-qPCR就是MeRIP实验后进行的qPCR实验。这里的MeRIP实验同MeRIP-seq测序中MeRIP实验相同，实验基本操作也一致：对RNA进行片段化，然后将片段化后的RNA样品分为二部分：一部分用于免疫共沉淀实验（IP）后作为IP样品，另一部分不进行IP直接作为Input样品。之后再根据实验目的的不同，对两部分RNA片段进行逆转录和qPCR或者建库测序。

  MeRIP-qPCR的目的是对定量修饰位点的表达水平，因此设计的引物不仅要针对目标基因，还要针对基因上发生修饰的位点（区域）。那修饰位点的信息怎么获得呢？一般有以下几个途径：

  MeRIP-seq报告结果中通常会给出发生甲基化修饰的位置坐标（如云序生物报告中会以chr1:11的形式给出发生甲基化修饰的区域坐标位置信息）。然后就能够准确的通过位置信息在UCSC genome browser网站（）获取这段修饰区域的序列（注意基因组版本的选择）。

  确认位置信息正确后，键盘按V+D，弹出页面，点击get DNA，就可以获得修饰区域的序列信息。保存后进行引物的设计：

  如果没有测序结果，想直接通过MeRIP-qPCR验证关注的某基因上是不是真的存在修饰区域，就只可以通过预测得到发生修饰概率高的区域位置，再针对位点设计引物，进行qPCR实验。网站的预测通常是基于研究公认的该种修饰具有的motif序列等进行预测，在网站输入目标RNA的序列后，就可生成预测结果。

  *其中DF和IF是稀释倍数。如最初用于IP和Input的RNA的比例为a：b，则在计算%(IP/Input)值时，需要乘以稀释倍数b/a（经过IP实验得到的RNA量一定少于不做IP实验的Input的RNA量，且逆转录+qPCR的使用的IP和Input的模板量也不同，因此要在计算的时候将差异倍数考虑进去）。通常用于逆转录的Input RNA量为1 μg，则DF=1/（用于IP的RNA的量）。

  例如，实验组和对照组片段化后的总RNA均为21 μg。分别取其中的20 μg的RNA用于IP实验，剩下1 μg的RNA用做Input样品。对IP后的RNA样品及Input RNA进行逆转录（由于IP后RNA样品量较少，建议不测浓度，直接全部用于逆转录）。得到以下Ct值后进行下一步计算：

  前两个环节谈到过，IP是用该修饰的特异性抗体，通过免疫共沉淀富集带修饰的片段，Input是不进行富集的所有片段，这两个是MeRIP-qPCR必做的，每个样品分别做了这两部分的PCR结果合起来计算才能体现修饰水平，达到实验的目的。而IgG是用非特异性抗体，通过免疫共沉淀富集非特异性结合的片段，可作为对IP的对照，证明IP的信号不是源自抗体非特异性结合，而确实是针对发生修饰的片段（IgG可以选做）。

  如果有两组样品，展示一个目的基因在两组间的修饰水平。或者一组样品，展示多个基因的修饰水平差异，可以只做IP和Input，展示%（IP/Input）值[1, 2]。

  *为了便于直观体现组间的比较，有时会将所有%（IP/Input）数值统一除以某组样品或某个基因的%（IP/Input）数值，使柱状图中该组样品或该基因的柱高变为1，相当于全部以某组样品或某个基因为基准展示相对修饰水平。经这种处理后通常纵坐标会称为relative enrichment、relative level[3, 4]。

  如果为了严谨的证明实验体系没问题，或者验证指标只有一个分组/一个基因但需要一个对照，可以同时多做一个IgG，在结果展示%（IP/Input）和%（IgG/Input）两个柱子对照[5, 6]。

  如果做了IgG对照，还可以再一次进行选择用Fold Enrichment来展示，富集倍数%(IP/Input)/%( IgG/Input)，即IP比对照的IgG信号高多少倍，也可拿来体现修饰的水平。通常是分组和基因都是多个时不想一一单独展示IgG[7]。

  相信通过上面的学习，你已经基本掌握MeRIP-qPCR这项技能啦！但由于与普通PCR存在很多异同，可能你还是会存在一些疑问。放心！云序生物这就给你解答！

  传统的RT-qPCR中，每个样本都要做一个内参基因，如哺乳动物会选择GAPDH，而miRNA则会选择U6。那么是不是m6A-IP-qPCR就真的没内参了呢？其实也不是！实际上我们会发现整个input充当了内参基因的概念，一个基因的甲基化水平是无法直接用RIP下来的RNA在做qPCR后直接用Ct值高低来衡量的，需要input中的RNA作为背景。而IgG抗体的加入则是为了排除m6A抗体非特异性结合情况出现。由于有时候m6A抗体不同厂家、保质期、蛋白性能等因素可能会产生非特异性结合的结果，这时候就需要用IgG来排除这部分的干扰。目前市面上使用的绝大部分m6A抗体为兔抗，那么尽量在使用IgG做对照时也使用兔抗来源的IgG。

  另外，从结果的形式%（IP/Input）也能够准确的看出，MeRIP-qPCR实验侧重看修饰的片段（IP样品qPCR结果）占总片段（Input样品qPCR结果）的比例，实验目的只是要得到这两者的比值就体现修饰水平，因此MeRIP-qPCR不需要内参。

  例如：针对目的基因目的位点qPCR，样品A的IP结果0.2，Input结果1；样品B的IP结果0.3，Input结果1.5，得到的%（IP/Input）结果显示两个样品甲基化水平数值都是0.2，修饰水平无差异，到此就达到了目的。

  前面第1点主要从多个样品比较的角度解释了MeRIP-qPCR为何不需要内参基因。而有时也会出现以下情况：1）没有分组对比，只想看下这一个（组）样品中该基因有没有修饰：结果的%（IP/Input）达到多少可算作有修饰？2）想看看MeRIP实验体系有没问题，想做个已知有修饰的基因当阳性对照看看效果。

  针对这两种情况，回答是目前没有一个定值，也没有一个稳定修饰的基因可以做参考。但针对第一种情况，可以在进行实验时，同时做一个非特异性IgG抗体的免疫沉淀富集，对比样品本身的IP和IgG是否有显著差异，放在文章中也可作为该位点有某些特定的程度的修饰的证据。RNA修饰是一个动态可逆的酶促反应，在相同组织细胞中的水平可能都会随着环境千变万化，不同组织中更是差别很大。与普通qPCR检测基因表达时能找到稳定表达的看家基因不同，MeRIP-qPCR没有一个稳定修饰的基因做参照，目前RNA修饰文章也不要求有这种参照。不过也可做IgG对照检测体系的特异性。

  因此，在云序生物的GenSeq m6A MeRIP试剂盒中，我们贴心的为客户提供了IgG抗体以及m6A的一对阳参引物和一对阴参引物（根据文献报道：靶向 HEK293 细胞中 m6A 修饰的某段 RNA 区域（Positive Primers）和无 m6A 修饰的某段 RNA 区域（Negative Primers）），供有条件且感兴趣的用户验证实验效率和抗体特异性。但如前面所说，m6A修饰具有很强的细胞类型特异性，没办法保证在任何细胞系或样品中，该引物都能作为很好的参照。因此，建议想对实验体系进行进一步自验证的用户，采用HEK293细胞的RNA做验证实验。

  可能有人会想：Input样品又没经过IP，qPCR操作不就与普通qPCR没什么差别，那么做了MeRIP-qPCR，不能得到基因表达量的结果吗？比如前面MeRIP-qPCR例子中A和B样品Input分别是1和1.5的结果能用来看一下这个基因在两样品中的表达量有没有差异？——我们不知道，因没有内参基因来计算，要看表达量的线的差异是否是如前一段那样由于用量差异等因素带来的了。因此通常说起MeRIP-qPCR，结果不能用来体现基因表达量。

  那如果在MeRIP-qPCR步骤中直接多扩增一个内参基因，与目的基因Input联合在一起定量表达量是否可行？我们只可以说可以借鉴，不过由于MeRIP实验是有片段化这一步骤的，PCR信号会弱一些，对于验证表达量的目的来说还是推荐采用常规的qPCR步骤会更准确、风险更小。

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